Advisor | Rabello, Ana Lúcia Teles | pt_BR |
Author | Cardoso, Fernanda Alvarenga | pt_BR |
Access date | 2013-08-14T17:17:44Z | |
Available date | 2013-08-14T17:17:44Z | |
Document date | 2013 | |
Citation | CARDOSO, Fernanda Alvarenga. Desenvolvimento e validação de um ensaio de PCR-ELISA para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana em amostras de sangue periférico. 2013. 109 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde, concentração em Doenças Infecciosas e Parasitárias) - Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2013. | pt_BR |
URI | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/6791 | |
Abstract in Portuguese | Nas últimas décadas, a reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) com diferentes objetivos: o diagnóstico da infecção, da doença e o controle de cura. Para utilização em larga escala, a etapa de eletroforese para detecção dos produtos amplificados na PCR, torna a técnica complexa e onerosa. A PCR-ELISA representa uma alternativa de detecção do produto amplificado por PCR através de um ensaio imunoenzimático (ELISA). Esta técnica é capaz de conferir maior sensibilidade e rapidez para a análise de grandes números de amostras clínicas com o uso de equipamentos utilizados para processamento de ELISA e, portanto, permite realizar PCR para fins de diagnóstico em laboratórios de média complexidade. Assim, este estudo objetivou desenvolver e validar o método de detecção colorimétrica dos produtos de amplificação gerados pela reação de PCR para o diagnóstico da LV em amostras de sangue periférico.O método de PCR-ELISA foi desenvolvido para detecção de fragmento de DNA do cinetoplasto (kDNA), complexo Donovani-específico. Utilizando-se cepas referências de Leishmania em cultivo e de painel de amostras de sangue periférico humano de 11 indivíduos não infectados, moradores de área endêmica e 14 casos de LV, caracterizadas clínica e parasitologicamente, determinou-se o limite de detecção da reação, medidas de precisão (repetibilidade e reprodutibilidade) e limite entre positivo e negativo (cut-off). A avaliação do desempenho do ensaio foi realizada com amostras de sangue periférico de 105 pacientes portadores de LV, 25 pacientes portadores da co-infecção Leishmania/HIV e de 73 indivíduos moradores de área endêmica para a LV. Foi desenvolvido ainda um ensaio de PCR-ELISA para detecção do DNA amplificado do gene humano ACTB, para uso como controle do processo de extração de DNA e amplificação por PCR das amostras clínicas. O ensaio PCR-ELISA kDNA desenvolvido apresentou limite de detecção de 1 parasito/mL de sangue e 0,07fg/µL de DNA de L. (L.) infantum, sensibilidade de 100% (IC 95%: 97,1 a 100%) e especificidade de 95% (IC 95%: 83,5 a 98,6%). Todos os indivíduos assintomáticos de área endêmica, com positividade por outras técnicas diagnósticas, foram também positivos pela PCR-ELISA. Todas as amostras foram testadas satisfatoriamente para o ensaio de PCR-ELISA ACTB. O ensaio de PCR-ELISA kDNA, desenvolvido e validado neste estudo, apresenta simplicidade metodológica e operacional, permite interpretação objetiva da amplificação por PCR do DNA de Leishmania do complexo Donovani e desempenho adequado no diagnóstico da LV em laboratórios de referência. | pt_BR |
Language | por | pt_BR |
Rights | open access | pt_BR |
Subject in Portuguese | Leishmaniose Visceral | |
Subject in Portuguese | Diagnóstico | |
Subject in Portuguese | Leishmania donovani | |
Subject in Portuguese | Parasitologia | |
Subject in Portuguese | Reação em Cadeia da Polimerase | |
Subject in Portuguese | Métodos | |
Subject in Portuguese | Coleta de Amostras Sanguíneas | |
Title | Desenvolvimento e validação de um ensaio de PCR-ELISA para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana em amostras de sangue periférico | pt_BR |
Type | Dissertation | pt_BR |
Defense date | 2013 | pt_BR |
Defense Institution | Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou | pt_BR |
Place of Defense | Belo Horizonte/MG | pt_BR |
Program | Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde | pt_BR |
Co-Advisor | Gomes, Luciana Inácia | pt_BR |
Abstract | In recent decades, the polymerase chain reaction (PCR) has been used for the diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) with different goals: diagnosis of infection, disease control and cure. For large-scale use, the step of electrophoresis to detect amplified products of PCR makes this technique more complex and costly. The PCR-ELISA is an alternative for the detection of the amplified PCR product through an immunoenzymatic assay (ELISA). This technique offers higher sensitivity and speed for the analysis of large numbers of clinical specimens, using equipment widely used for processing sets of ELISA and therefore allows performing PCR for diagnostic purposes in laboratory of medium complexity. Thus, this study aimed to develop and validate the colorimetric detection method (ELISA) for amplification products generated by PCR targeting the diagnosis of VL.The method of PCR-ELISA was developed to detect a fragment of DNA of kinetoplast (kDNA) specific from Leishmania donovani complex. Using reference strains of Leishmania in cultivation and a panel of human peripheral blood samples of 11 non-infected individuals, residents of endemic area and 14 cases of VL with clinical and parasitological characterization, we determined the detection limit of the reaction, precision measurements (repeatability and reproducibility) and limit between positive and negative (cut-off). The performance of the assay was evaluated with peripheral blood samples of 105 patients with VL, 25 patients showing the co-infection Leishmania/HIV and 73 individuals living in endemic areas for VL. A PCR-ELISA assay for detection of DNA from the human ACTB gene was also developed for use as control for the process of DNA extraction and amplification by PCR of clinical samples. The PCR-ELISA kDNA assay developed showed a detection limit of 1 parasite/ml blood and 0.07 fg/µL of DNA from L. (L.) infantum. The assay showed a sensitivity of 100% (IC 95%: 97.1 to 100%) and specificity of 95% (IC 95%: 83.5 to 98.6%). All asymptomatic individuals from an endemic area, who were diagnosed for LV by other techniques, were also positive by PCR-ELISA kDNA. All samples were tested satisfactorily by PCR-ELISA ACTB assay. The PCR-ELISA kDNA assay was developed and validated in this study. It presents methodological and operational simplicity; enables objective interpretation of PCR amplification of DNA from Leishmania donovani complex and have sufficient performance for diagnosis of VL in reference laboratories. | pt_BR |
Affilliation | Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. | pt_BR |
Member of the board | Rabello, Ana Lúcia Teles | pt_BR |
Member of the board | Romero, Gustavo Adolfo Sierra | pt_BR |
Member of the board | Coelho, Paulo Marcos Zech | pt_BR |
Member of the board | Avelar, Daniel Moreira de | pt_BR |
DeCS | Leishmaniose Visceral | pt_BR |
DeCS | Leishmania donovani | pt_BR |
DeCS | Reação em Cadeia da Polimerase | pt_BR |
DeCS | Coleta de Amostras Sanguíneas | pt_BR |