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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/51184
QUANTIFICAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA EM AMOSTRAS COLETADAS DE BORDA INTERNA E EXTERNA DE LESÕES CUTÂNEAS ULCERADAS DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA
Silva, Caio Thomaz de Lima e | Date Issued:
2020
Author
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
As leishmanioses constituem um grupo de doenças infecciosas de transmissão vetorial, causadas por protozoários do gênero Leishmania que acometem o ser humano e animais. No Brasil, a leishmaniose cutânea (LC) é uma doença com registro de casos e de vetores em todo território nacional. A úlcera típica da leishmaniose cutânea é arredondada, indolor, base infiltrada e endurecida, bordas bem delimitadas e elevadas, variando de uma a poucas lesões na maioria dos casos. A pesquisa direta de formas amastigotas, com o auxílio da microscopia ótica, é o método mais simples e tradicional utilizado no diagnóstico da doença. Consiste em pesquisar o parasito em material obtido de escarificação da borda das lesões, sem a necessidade de anestesia local. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) vem alcançando cada vez mais aplicabilidade no campo do diagnóstico das leishmanioses, principalmente por sua alta sensibilidade, superando os métodos diretos. O exame histopatológico, apesar da baixa sensibilidade para o diagnóstico da LC, é útil no diagnóstico diferencial, além de permitir estudar os tipos e a distribuição de células na lesão. Segundo as recomendações da Organização Mundial de Saúde, o local de eleição para coleta de material para diagnóstico da LC é a borda da lesão, pois supõe-se que essa localização contenha a maior quantidade de parasitos. Entretanto, alguns autores têm observado uma maior carga parasitária na borda interna da lesão quando comparado com a borda externa. No Brasil, o Ministério da Saúde recomenda a borda interna. Este estudo tem como objetivo avaliar comparativamente a carga parasitária e o perfil histopatológico na borda interna e externa de lesões cutâneas ulceradas de LC. Para avaliar a diferença quantitativa nas duas localizações, foi utilizada a PCR quantitativa (qPCR) O DNA foi extraído de material de lâminas coletadas previamente, fixadas com metanol e coradas com Giemsa. A quantificação das amostras foi realizada pela qPCR utilizando o sistema SYBR Green com primers direcionados ao minicírculo do kDNA de Leishmania (Viannia) braziliensis e gen \03B2-actina. Foram recuperados blocos de parafina de 19 pacientes, dos quais foram preparadas lâminas coradas pela hematoxilina-eosina para avaliação semi quantitativa dos tipos celulares presentes em cada um dos locais da lesão. Foram analisadas lâminas confeccionadas com material proveniente de escarificação das bordas interna e externa, imprint e histopatologia, totalizando 156 lâminas provenientes, respectivamente, de 39 pacientes diagnosticados com LC. Tanto pela qPCR, quanto pelo exame direto foi possível observar maior carga parasitária na borda interna da lesão em relação à borda externa e imprint. Pela análise histopatológica também foi encontrado um maior índice parasitário na borda interna da lesão. Apesar da menor quantidade de parasitos por lâmina, o imprint permitiu o diagnóstico em 27 pacientes, comparado com 23 diagnósticos na borda interna. Talvez, a menor quantidade de artefatos nas lâminas de imprint facilite a visualização das formas amastigotas. Entretanto, o uso da escarificação na rotina de diagnóstico apresenta vantagens, por ser uma técnica simples, pouco invasiva, que não requer anestesia e que pode ser realizada repetidas vezes, por profissional não médico, em áreas endêmicas. Portanto, os resultados sugerem que a escarificação da borda interna da lesão seja o método indicado para coleta de amostras com fins de diagnóstico molecular e exame direto
Abstract
Leishmaniasis is a group of vector borne infectious diseases, caused by protozoa of the genus Leishmania that affects humans and animals. In Brazil, cutaneous leishmaniasis (CL) is a disease with registered cases and vectors throughout the national territory. A typical ulcer of cutaneous leishmaniasis is rounded, painless, the base is infiltrated and hardened, with well-defined and high edges, varying from one to a few lesions in most cases. The direct search for amastigotes, by optical microscopy, is the simplest and most traditional method used in the diagnosis of the disease. The parasite is searched in clinical specimens obtainained by scrapings in the borders of the lesions, without the need for local anesthesia. The polymerase chain reaction (PCR) have been increasingly applied in the field of leishmaniasis diagnosis, mainly due to its high sensitivity, surpassing the traditional methods. Histopathological examination, despite the low sensitivity for the diagnosis of CL, is useful in the differential diagnosis, in addition to allowing the study of cell types and the distribution in the lesion. According to the recommendations of the World Health Organization, the selection site for the collection of material for the diagnosis of CL is the edge of the lesion, since it is supposed to contain a greater number of parasites. However, some authors have observed a greater parasitic load on the inner edge of the lesion when compared to the outer edge. This study aims to comparatively evaluate the parasitic load and the histopathological profile on the inner and the outer edge of skin ulcerated lesions of CL. To assess the parasitc load difference in these two locations, quantitative PCR (qPCR) was used DNA was extracted from material from previously collected slides, fixed with methanol and stained with Giemsa. We used SYBR Green system with primers directed to the kDNA minicircle of Leishmania (Viannia) braziliensis and the \03B2- actin gen. Slides made with material from the inner and the outer edge scraping, imprint and histopathology were analyzed, totaling 156 slides from, respectively, 39 patients diagnosed with CL. Both through qPCR and direct examination it was possible to observe a greater parasitic load on the inner edge of the lesion in relation to the outer edge and imprint. Histopathological analysis also found a higher parasitic index on the inner edge of the lesion. Despite the lower number of parasites per slide, the imprint allowed the diagnosis in 27 patients, compared with 23 diagnoses at the inner edge. Perhaps, the smallest amount of artifacts on the imprint slides facilitate the visualization of some amastigotes. However, the use of scraping technique in the diagnostic routine has some advantages, as it is a simple, low-invasive technique that does not require anesthesia and can be performed repeatedly by a non-medical professional in endemic areas. Therefore, the results suggest that the scraping technique of the inner edge of the lesion is the recommended method for collecting samples for the purposes of molecular diagnosis and direct examination
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