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CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS IGY CONTRA O VÍRUS DA HEPATITE B E AVALIAÇÃO DE POTENCIAL USO EM ENSAIO DE DIAGNÓSTICO
Imunoglobulina G
Técnicas Imunoenzimáticas
Diagnóstico
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
Imunoglobulina G
Técnicas Imunoenzimáticas
Diagnóstico
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
Deodato, Raíssa Martins | Date Issued:
2021
Author
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Os testes comerciais para detecção de HBsAg utilizam imunoglobulina G (IgG) específicas de mamíferos como anticorpos de captura e conjugado. Uma alternativa à aplicação destes anticorpos no diagnóstico é o uso de imunoglobulina Y (IgY), encontrada no soro e na gema de ovos de aves e repteis. Estas proteínas têm várias vantagens quando comparadas a IgG: alta reposta contra antígenos de mamíferos, redução da cor de fundo em ensaios imunoenzimáticos e o fato de serem obtidas por um método não invasivo (coleta da gema dos ovos). O objetivo geral deste estudo é caracterizar a proteína IgY específica para o vírus da hepatite B (HBV) e avaliar seu potencial uso em um teste de diagnóstico para infecção pelo HBV. A produção dos anticorpos foi realizada via imunização das aves (grupo 1 - vacina Butang® ; grupo 2 - vacina Butang® mais adjuvante CpG-ODN; grupo 3 - PBS), as aves tiveram sua evolução de peso e postura de ovos monitorada. Os ovos foram coletados por 20 semanas e as gemas purificadas por polietileno glicol e cromatografia de afinidade. A solução contendo IgY anti-HBs foi caracterizada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e a avaliação da especificidade por meio da técnica de dot blot e Western Blot e a concentração de proteínas totais da solução purificada foi dosada por espectrofotometria. Em seguida, a IgY purificada foi submetida a conjugação com peroxidase de rábano (HRP) utilizando duas metodologias distintas (gel filtração e método de periodato). O primeiro teste avaliou a IgY purificada como anticorpo de captura em ensaio imunoenzimático Anti-HBs comercial. Posteriormente foram realizados ensaios para avaliar a padronização de um ELISA para detecção do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) utilizando apenas os anticorpos IgY, como captura e conjugados IgY/HRP produzidos. Também foi avaliado o emprego da IgY como captura e anticorpo primário, utilizando um Anti-IgY/HRP para a revelação da reação. Por fim, visando a padronização de um ensaio Anti-HBs, foi avaliado um conjugado IgG/HRP em placas de ELISA sensibilizadas com IgY. Para a titulação dos anticorpos de captura IgY e conjugados, foram empregadas amostras de soro de indivíduos positivos e negativos para hepatite B. Como resultado, observamos a presença de IgY pelo padrão molecular no SDS-PAGE, e confirmamos a especificidade por dot blot e Western Blot. A dosagem média de proteínas totais no grupo 1 foi de 3,269 ± 2,996 mg/mL e no grupo 2 foi 3,109 ± 3,115 mg/mL e o grupo 3 não foi avaliado. A IgY purificada foi empregada como anticorpode captura onde foi possível distinguir amostras reagentes e não reagentes pela técnica de ELISA utilizando um conjugado de kit de diagnóstico anti-HBs comercial, porém, não foi realizada testagem em painel de amostras. Os conjugados IgY/HRP produzidos não apresentaram bom desempenho, bem como a utilização da IgY como captura e anticorpo primário, portanto, foi padronizado um teste imunoenzimático contendo IgY anti-HBs como captura e o conjugado comercial IgG anti-HBsAg/HRP, que apresentou 28,8% de sensibilidade e 71,1% de especificidade. Como conclusão, a obtenção de IgY anti-HBs por meio da imunização de aves com vacina para HBV foi possível e satisfatória e a IgY pôde ser empregada como anticorpo de captura quando empregada em um ensaio comercial. No entanto, a sensibilidade e especificidade do anticorpo IgY precisam ser melhoradas para uma melhor detecção do HBsAg em teste de diagnóstico.
Abstract
Commercial tests for HBsAg detection use mammalian-specific immunoglobulin G (IgG) as capture and conjugate antibodies. An alternative to the application of these antibodies in diagnosis is the use of immunoglobulin Y (IgY), found in the serum and egg yolk of birds and reptiles. These proteins have several advantages when compared to IgG: high responsiveness against mammalian antigens, reduced background color in immunoassays, and the fact that they are obtained by a noninvasive method (egg yolk collection). The overall objective of this study is to characterize IgY protein specific for hepatitis B virus (HBV) and evaluate its potential use in a diagnostic test for HBV infection. The production of antibodies was performed via immunization of the birds (group 1 - Butang® vaccine; group 2 - Butang® vaccine plus CpG-ODN adjuvant; group 3 - PBS), the birds had their weight evolution and egg laying monitored. Eggs were collected for 20 weeks and yolks were purified by polyethylene glycol and affinity chromatography. The solution containing anti-HBs IgY was characterized in polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and specificity evaluation by dot blot and Western Blot technique and the total protein concentration of the purified solution was dosed by spectrophotometry. Then, the purified IgY was subjected to conjugation with horseradish peroxidase (HRP) using two different methodologies (gel filtration and periodate method). The first test evaluated the purified IgY as a capture antibody in commercial Anti-HBs immunoassay. Subsequently, assays were performed to evaluate the standardization of an ELISA for detection of hepatitis B surface antigen (HBsAg) using only IgY antibodies as capture and IgY/HRP conjugates produced. The use of IgY as capture and primary antibody, using an Anti-IgY/HRP for the reaction revelation was also evaluated. Finally, aiming to standardize an Anti-HBs assay, an IgG/HRP conjugate was evaluated on IgY-sensitized ELISA plates. For titration of IgY capture antibodies and conjugates, serum samples from hepatitis B positive and negative individuals were employed. As a result, we observed the presence of IgY by molecular pattern on SDS-PAGE, and confirmed the specificity by dot blot and Western Blot. The mean total protein dosage in group 1 was 3.269 ± 2.996 mg/mL and in group 2 was 3.109 ± 3.115 mg/mL, and group 3 was not evaluated. Purified IgY was employed as a capture antibody where it was possible to distinguish reacting and non-reacting samples by ELISA technique using a commercial anti-HBs diagnostic kit conjugate, however, panel testing of samples was not performed. The IgY/HRP conjugates produced did not show good performance, as well as the use of IgY as capture and primary antibody, therefore, an enzyme immunoassay was standardized containing IgY anti-HBs as capture and the commercial IgG antiHBsAg/HRP conjugate, which showed 28.8% sensitivity and 71.1% specificity. As a conclusion, obtaining anti-HBs IgY by immunizing birds with HBV vaccine was possible and satisfactory and IgY could be employed as a capture antibody when employed in a commercial assay. However, the sensitivity and specificity of IgY antibody need to be improved for better detection of HBsAg in diagnostic test.
Keywords in Portuguese
Hepatite BImunoglobulina G
Técnicas Imunoenzimáticas
Diagnóstico
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
DeCS
Hepatite BImunoglobulina G
Técnicas Imunoenzimáticas
Diagnóstico
Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
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