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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/40143
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AO ANTIMÔNIO EM ISOLADOS CLÍNICOS DE LEISHMANIA BRAZILIENSIS OBTIDOS DE LESÕES ATÍPICAS
Quimioterapia
Resistência ao antimônio
Marcadores de resistência
Lesões atípicas
Chemotherapy
Antimony resistance
Resistance markers
Atypical lesions.
Antimônio/uso terapêutico
Leishmaniose/afecções associadas
Rugani, Jeronimo Marteleto Nunes | Date Issued:
2019
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract in Portuguese
As leishmanioses cutâneas (LC) e mucocutâneas (LM) são causadas por várias espécies de Leishmania sendo a mais importante no Brasil a L. braziliensis. Um aspecto importante da LC causada por essa espécie é a ocorrência de lesões atípicas não-ulceradas que podem não responder ao tratamento com antimônio (Sb). Deste modo, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a susceptibilidade de L. braziliensis obtidas de pacientes com lesões típicas e atípicas aos agentes antileishmania utilizados na prática clínica – anfotericina B (AmB), miltefosina (MIL) e glucantime (GLU). Todos os isolados foram sensíveis à AmB e MIL, sendo que este último, apesar de eficaz, apresenta baixa correlação entre a taxa de infecção e o número de amastigotas/macrófago. Apenas os isolados de L. braziliensis provenientes de lesões atípicas (316, 330 e 340) foram resistentes ao Sb (SbR) e apresentaram menor infectividade em macrófagos THP-1. A resistência ao Sb foi atribuída à redução de incorporação do fármaco, como revelado pelo ensaio de quantificação de Sb intracelular utilizando absorção atômica, associada ao aumento de transcritos dos genes ARM56 e ARM58. A diminuição nos níveis de mRNA de AQP1 corroborram os achados funcionais de redução do acúmulo de Sb em parasitos SbR. O sequenciamento do gene que codifica para AQP1 revelou a presença de polimorfismos exclusivos tanto em cepas isoladas de lesões típicas como atípicas, apesar dessas mutações serem silenciosas. Não houve diferença entre os isolados clínicos de L. braziliensis frente ao choque hiposmótico. Leishmania braziliensis isolada de lesões típicas e sensíveis ao Sb apresentaram níveis de transcritos que codificam para gama-glutamil cisteína sintase e do transportador ABCI4, ambos alvos associados ao metabolismo de Sb. A incorporação diferencial de Sb em isolados clínicos de L. braziliensis nos levou a testar o papel de glicoconjugados da superfície dos parasitos na entrada de Sb. Para isso, o isolado 346 – que apresentou maior acúmulo de Sb – foi incubado na presença do anticorpo CA7AE, cuja função de aglutinação de glicoconjugados parece favorecer a entrada de Sb e pode ser utilizado como ferramenta para melhor compreender a dinâmica de transporte do Sb. Estes dados destacam a importância de se caracterizar molecular e funcionalmente isolados clínicos de Leishmania spp. com o intuito de identificar previamente a resistência a fármacos e guiar a escolha do melhor tratamento. A identificação concomintante de diferentes marcadores pode ser utilizada com estratégia para desenvolver uma ferramenta/kit preditivo voltado para a vigilância e controle das leishmanioses.
Abstract
Cutaneous (LC) and mucocutaneous (LM) leishmaniasis are caused by several species of Leishmania and the most important species in Brazil is L. braziliensis. An important aspect of LC caused by this species is the occurrence of non-ulcerated atypical lesions that may not respond to antimony (Sb) treatment. Thus, our main goal was to evaluate in vitro susceptibility of L. braziliensis obtained from patients with typical and atypical lesions to the antileishmania agents used in clinical practice - amphotericin B (AmB), miltefosine (MIL) and glucantime (GLU). All isolates were sensitive to AmB and MIL, and the latter, although effective, showed a lower correlation between infection rate and number of amastigotes/macrophage. Only L. braziliensis from atypical lesions (316, 330 and 340) were resistant to Sb (SbR) and showed lower infectivity in THP-1 macrophages. Resistance to Sb was attributed to the reduction of drug incorporation, as revealed by the intracellular Sb quantification assay using atomic absorption, associated with increase of transcripts from ARM56 and ARM58 genes. The decrease in AQP1 mRNA levels corroborates the functional findings of reduction of Sb accumulation in SbR parasites. Sequencing of the gene encoding AQP1 revealed the presence of a unique genetic profile both in strains isolated from typical and atypical lesions, although such mutations were silent. There was no difference in the behavior of L. braziliensis clinical isolates to hyposmotic shock. Leishmania braziliensis isolated from typical lesions and sensitive to Sb presented levels of transcripts coding for gamma-glutamyl cysteine synthase and ABCI4 carrier, both targets associated with Sb metabolism. The differential Sb incorporation in L. braziliensis clinical isolates led us to test the role of glycoconjugates of the parasites at the entrance of Sb. For this, isolate 346 - which had the highest accumulation of Sb - was incubated in the presence of the CA7AE antibody, whose function of glycoconjugates agglutination seems to favor the Sb uptake and can be used as a tool to better understand the transport dynamics of Sb. These data highlight the importance of molecularly and functionally characterizing clinical isolates of Leishmania spp. in order to identify drug resistance and guide the choice of the best treatment. The concomitant identification of different markers can be used as strategy to develop a predictive tool / kit for surveillance and control of leishmaniasis.
Keywords in Portuguese
Leishmania braziliensisQuimioterapia
Resistência ao antimônio
Marcadores de resistência
Lesões atípicas
Keywords
Leishmania braziliensisChemotherapy
Antimony resistance
Resistance markers
Atypical lesions.
DeCS
Leishmania braziliensis/efeito dos fármacosAntimônio/uso terapêutico
Leishmaniose/afecções associadas
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