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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/3963
MONITORAMENTO DO GENE, QUE CODIFICA A ESTERASE, ENVOLVIDO NA RESISTÊNCIA A INSETICIDAS ORGANOFOSFORADOS EM POPULAÇÕES NATURAIS DE AEDES AEGYPTI DO BRASIL
Paiva, Marcelo Henrique Santos | Date Issued:
2006
Alternative title
Monitoring of the esterase encoding gene, involved in the resistance to organophosphate insectices in natural populations of Aedes aegypti in BrazilAffilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.
Abstract in Portuguese
O objetivo principal deste trabalho foi analisar o polimorfismo genético do gene da esterase e, avaliar o seu papel em possíveis mecanismos de resistência ao temephos em populações de Aedes aegypti. Com este propósito, foram utilizadas duas linhagens de laboratório: a Rockefeller (padrão de susceptibilidade a todas as classes de inseticidas) e a Recife-Resistente (mantida sob forte pressão de seleção pelo temephos durante cinco gerações); e nove populações naturais: oito provenientes da região metropolitana do Recife e uma de Araripe (CE). Elas foram coletadas em forma de ovos, durante os anos de 2004 e 2005. Foram realizados ensaios bioquímicos, eletroforese de isoenzimas, PCR e seqüenciamento de parte do gene, e PCR em Tempo Real para comparar a quantidade de cópias do gene na linhagem resistente e susceptível, e em populações naturais. Testes bioquímicos realizados apenas na linhagem Recife-Resistente demonstraram a presença do mecanismo de resistência metabólica através de uma alta atividade esterásica. O padrão das esterases foi observado em nove populações, em géis de poliacrilamida 6 por cento, corados com substratos específicos para as enzimas alfa e beta-esterase. Os valores de heterozigosidade observada (Ho) variaram de 0,278 a 0,533 em 2004, e em 2005, de 0,388 a 0,608. Estes géis ainda apresentaram um loco de alta atividade esterásica, denominado de loco 1. Neste loco, o alelo responsável pela maior atividade esterásica foi chamado de 3. Sua freqüência variou em 2004 de 0,100 em Dois Irmãos a 0,191 em Alto José do Pinho, e em 2005, caiu para 0,071 e 0,107 respectivamente. Na linhagem Recife-Resistente, a freqüência deste alelo foi de 0,214. O seqüenciamento de parte do exon 4 do gene da alfa-esterase, mostrou que o fragmento analisado, de aproximadamente 180 pb, é relativamente conservado, apresentando somente quatro sítios polimórficos em seis populações estudadas. Os resultados da PCR em Tempo Real indicaram que as populações estudadas não apresentam amplificação gênica para o gene da alfa-esterase, quando comparadas à linhagem Rockefeller, com exceção das populações de Engenho do Meio e Araripe. [...] estes resultados ainda precisam de maiores comprovações a fim de se assegurar que a superexpressão dos genes é a possível causa da resistência. A freqüência do alelo superexpresso pode ser monitorada ao longo do tempo e auxiliar no manejo da resistência ao inseticida químico em populações tratadas
Abstract
Resistance to chemical insecticides has been described to a vast order of insects
and represents one of the greatest challenges for obtaining success in control
programs of disease vectors. Resistance mechanisms to chemical insecticides can
be divided in categories, including target-site insensitivity and metabolic
mechanisms, through the expression of the organism detoxifying enzymes, such
as esterases. At the moment, esterases have been identified as the main
mechanism conferring resistance to organophosphates in Aedes aegypti. The main
objective of this study was the analysis of the esterase genetic polymorphism and,
to evaluate its role in possible mechanisms of resistance to temephos in natural
populations of this mosquito. To answer these questions, we used two laboratory
strains: Rockefeller (susceptibility model for all the insecticides groups) and the
Recife-Resistente (kept under strong selective pressure by temephos for five
generations), and nine natural populations: eight from the metropolitan area of
Recife and one from Araripe (CE). These populations were collected as eggs,
during the years 2004 and 2005. It was performed techniques such as biochemical
assays, isozymes electrophoresis, PCR and sequencing of part of the gene, and
Real-Time PCR to compare the amount of gene copies of the gene in a resistant
and a susceptible strain, and in natural populations. Biochemical assays were run
only in Recife-Resistente strain and, the results showed the presence of the
metabolic mechanism of resistance, through high esterase activity. The esterases
pattern was observed in nine populations, in 6% polyacrylamide gel stained with
specific substrates to α and β-esterase enzymes. The observed heterozygosity
values (Ho) varied from 0,278 to 0,533 in 2004, and in 2005, from 0,388 to 0,608.
The gels also showed a region of high esterase activity, denominated locus 1. In
this locus, the allele responsible for the higher esterase activity was called 3. Its
frequency varied in 2004 from 0,100 in Dois Irmãos to 0,191 in Alto José do Pinho,
and in 2005, dropped to 0,071 and 0,107 respectively. In the Recife-Resistente
strain, the frequency of this allele was 0,214. The sequencing of part of exon 4
from the α-esterase gene showed that the analyzed fragment, approximately 180
pb long, is quite conserved, presenting only four polymorphic sites. The results
obtained by Real-Time PCR indicated that the populations submitted to the study
did not present gene amplification to the α-esterase gene, when compared to
Rockefeller strain, except the populations from Engenho do Meio e Araripe. Inspite
of the higher number of molecules presented by these two populations, the results
still need more proofs to guarantee that the superexpression of the gene is the
possible cause of the resistance. The frequency of the superexpressed allele can
be monitored through time and help the management of resistance to chemical
insecticides in field projects
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