Please use this identifier to cite or link to this item:
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/37283
IMPACTO FUNCIONAL DE PEQUENAS MUTAÇÕES EM MYCOBACTERIUM BOVIS BCG MOREAU EM COMPARAÇÃO COM MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CEPA H37RV
Schwarz, Marcos Gustavo Araujo | Date Issued:
2019
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A tuberculose continua sendo uma doença relevante no que diz respeito à saúde mundial. A doença é causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e a única medida profilática disponível é a vacinação com BCG, uma cepa atenuada derivada de M. bovis. BCG é uma família de diferentes cepas que possuem diferenças genéticas entre si. Pequenas mutações em sequências codificantes podem causar impactos funcionais relevantes, modificando drasticamente a função/estrutura da proteína ou até alterando o nível de expressão, devido à modificação de processos de transcrição/tradução. Para melhor compreender o impacto dessa categoria de mutação na biologia do BCG, identificamos e selecionamos casos de mutação em três loci preditos de estarem envolvidos em processos biológicos importantes para micobactérias, como metabolismo redox (dodecina \2013 rv1498A), metabolismo lipídico (homólogo de rv1371/2/3) e respiração anaeróbica (fumarato redutase). Essas mutações foram identificadas pela análise de genômica comparativa entre M. tuberculosis H37Rv e M. bovis BCG Moreau. Análises de RT-PCR e western blotting mostram que a transcrição e tradução desses genes não foram afetadas pelas mutações. Modelagem estrutural das proteínas mutadas indica um drástico impacto na atividade de dodecina, corroborado por nossos ensaios funcionais, diferentemente do complexo da fumarato redutase. Mutantes knockout foram criados e resultados preliminares mostram que o operon da fumarato redutase é funcional em BCG Moreau, já que o mutante \F044frd possui um fenótipo diferencial no crescimento quando comparado com a cepa selvagem Já para \F044rv1371/2/3 não foi observado tal padrão. Complementação da cepa selvagem com alelos de rv1371/2/3 de M. tuberculosis e BCG corrobora a hipótese de não-funcionalidade da cópia de BCG, já que identificamos lipídeos diferentes quando ambas as cepas foram comparadas. Não foi viável a inativação do gene codificante para dodecina, nem a construção da cepa de knockdown condicional, que seria utilizada para analisar a essencialidade desse gene. Complementação de M. smegmatis com os alelos de rv1498A de M. tuberculosis e BCG mostram que ambas as cópias resultaram em maior crescimento das cepas em meio axênico, em uma magnitude similar para ambos os alelos em comparação com a cepa selvagem. Análises proteômicas revelam que diversos genes com pequenas mutações que possuem diferenças em seu nível de expressão quando comparadas as diferentes fases de crescimento estão envolvidos em metabolismo lipídico, revelando a importância de se investigar tal característica. Nossos resultados mostram que algumas mutações preditas podem não causar o impacto funcional esperado, provavelmente porque forças seletivas podem estar atuando sob esses loci.
Abstract
Tuberculosis remains a very important health issue worldwide. The disease is caused by Mycobacterium tuberculosis and the available prophylaxis is vaccination with BCG, an attenuated strain derived from M. bovis. BCG comprises a family of different strains with significant genetic differences. Small mutations in coding sequences may cause huge functional impacts, drastically modifying the function/structure of the protein or even altering expression levels due to the modification of transcription/translation processes. To better understand the impact of this type of mutations in BCG biology, we identified and selected mutations in three loci predicted to be involved in important biological processes for mycobacteria, such as redox (dodecin – rv1498A) and lipid metabolism (rv1371/2/3 ortholog), and anaerobic respiration (fumarate reductase). These mutations were identified by comparing the M. tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG Moreau genomes. We showed by RT-PCR and western blotting analysis that transcription and translation of these genes were not hampered by the mutations. Structural modeling of the mutated proteins predicts a drastic impact on dodecin activity, corroborated by our functional assays, but not on the activity of the fumarate reductase complex. Knockouts were created, and preliminary results show that the fumarate reductase operon is active in BCG Moreau, as a frd mutant shows a drastic growth phenotype when compared to the wild-type strain. On the other hand, a rv1371/2/3 strain does not show any growth phenotypes when compared to the wildtype. Complementation of the wild-type strain with both M. tuberculosis and BCG
rv1371/2/3 alleles corroborates the non-functionality of the BCG gene, as we identified different lipids when comparing both bacterial strains. Neither the inactivation of the gene encoding dodecin nor the construction of a conditional knockdown strain, which would be used to assess gene essentiality, were successful. Complementation of M. smegmatis with the two rv1498A alleles (M. tuberculosis and BCG) resulted in increased growth of both strains on axenic medium, to a similar extent, when compared
to the wild-type strain. Proteomics analyses were performed and showed that several genes with small mutations and that had different expression levels when comparing growth phases were involved in lipid metabolism, showing that this phenomenon should be further investigated. Our results show that some predicted mutations may not have the expected functional impact, probably due to the selective forces that act on these loci.
Share