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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/36062
ESTUDO DO EFEITO ANTI-APOPTÓTICO DO MYCOBACTERIUM LEPRAE EM CÉLULAS DE SCHWANN HUMANAS
Células de Schwann
Sobrevivência
Fator de crescimento insulin-Like I
NF-Kappa B
Rodrigues, Luciana Silva | Date Issued:
2005
Author
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
A Hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, apresenta como sintoma clínico mais relevante lesões no sistema nervoso periférico. As estratégias utilizadas pelo M. leprae para infectar e se multiplicar nas células de Schwann (CS) são, contudo, pouco conhecidas. Neste trabalho investigamos a capacidade do M. leprae de proteger a célula hospedeira da morte, à semelhança do observado na literatura com outros patógenos intracelulares. Para tal, CS humanas da linhagem ST88-14 foram infectadas ou não com a bactéria foram tratadas com meio RPMI sem soro para induzir a apoptose e a viabilidade celular foi avaliada por dois métodos: i) capacidade celular de excluir o corante Azul de Tripan e ii) coloração com diacetato de fluoresceína e brometo de etídio. Após 48h de incubação, verificamos que somente 50% das células não infectadas permaneciam viáveis frente a 70 a 100% de proteção observada nas culturas infectadas. M. leprae foi capaz de proteger as CS da morte de maneira dose-dependente (1 a 50 bactérias/célula). A redução de células apoptóticas também foi observada pela marcação celular com DiOC6 através de Citometria de Fluxo. Em outra abordagem de nosso trabalho, demonstramos a participação de NF-kB na proteção de morte de CS pelo M. leprae com a utilização do inibidor SN50, específico para este fator transcricional Em seguida demonstramos que fatores solúveis secretados pela célula infectada estão envolvidos na proteção, visto que o meio condicionado proveniente de culturas infectadas também promoveu a sobrevivência de CS. Um possível candidato para esta ação protetora da bactéria poderia ser o fator de crescimento semelhante à Insulina-I (IGF-I). Confirmamos, então, a capacidade de M. leprae induzir a expressão de IGF-I em CS através da técnica de RT-PCR. Também demonstramos que IGF-I (50ng/mL) adicionado às culturas foi capaz de proteger as CS ST 88-14 de morte, possivelmente mediado pelo seu receptor (IGF-IR) cuja detecção foi observada através de Western blot e Citometria de Fluxo. Nossos dados sugerem uma importante estratégia para colonização bem sucedida do nervo pelo M. leprae, baseada na indução da expressão de IGF e conseqüente proteção da CS da morte.
Abstract
The lesions of the peripheral nervous are considered the most relevant symptoms of Leprosy, a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. The strategies employed by M. leprae to infect and multiply inside Schwann cells (SC) are, however, poorly understood. In this study we investigated whether, similarly to other obligate intracellular pathogens, M. leprae promotes an antiapoptotic effect on the host cell. Human SC lineage ST88-14 was treated or not with the bacteria and incubated in serum-free RPMI medium to induces apoptosis. The cell viability was monitored by three methods: i) cell capacity to reduce the methyltetrazolium salt (MTT); ii) Tripan blue exclusion and iii) cell staining with fluorescein diacetate and ethidium bromide. After 24-48h incubation, cells treated with M. leprae showed 70-100% of survival, contrasting with 30-60% in the untreated cultures. M. leprae anti-apoptotic effect was shown to be dose dependent. Reduction of cells undergoing apoptosis in cultures treated with M. leprae was also observed through DiOC6 staining by flow cytometry, a method that monitors the mithocondrial membrane potential. In a next step the conditioned medium of cells treated with M. leprae was shown to mimic the anti-apoptotic effect of the bacteria, suggesting that soluble factors secreted by SC in response to M. leprae were involved in cell survival. One possible candidate for these soluble factors would be InsulinLike Growth Factors, IGF-I and IGF-II. In fact, the capacity of M. leprae to induce the expression of IGF-I and IGF-II on SC was confirmed by RT-PCR. Also, when added to ST88-14 cells, recombinant IGF-I was able to protect the cells from apoptosis induced by serum withdrawn. IGF-I action is possibly mediated by the IGF-I receptor (IGF-IR), as ST88-14 cells were shown to express this receptor by Western blotting and FACS analysis. Finally, we showed that the pre-treatment of SC with one of the NF-B inhibitors, thalidomide, glyotoxin and SN50 completely abolished the anti-apoptotic effect of M. leprae. Altogether, our results suggest a important strategy for the successful colonization of M. leprae in the nerve, based on the survival maintenance of the host cell through induction of IGF production and NF-B activation.
Keywords in Portuguese
Mycobacterium LepraeCélulas de Schwann
Sobrevivência
Fator de crescimento insulin-Like I
NF-Kappa B
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