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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35695
PADRONIZAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL PARA DETECÇÃO DE CARBAPENEMASES DOS TIPOS KPC E NDM PRODUZIDAS POR BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS
Carbapenêmicos
Bactérias Gram-Negativas
Métodos de Análise
Controle de Qualidade
Vigilância Sanitária
Ribeiro, Sthefanie da Silva | Date Issued:
2016
Author
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) constituem um grave problema de saúde pública, tanto em países desenvolvidos, quanto naqueles em desenvolvimento. A vigilância sanitária possui papel fundamental para o controle e contenção da disseminação de patógenos carreadores de genes de resistência no ambiente hospitalar e na comunidade. O mecanismo mais importante associado à resistência aos ß-lactâmicos é a produção de β-lactamases que hidrolisam sua estrutura química causando a perda de função deste antimicrobiano. Os carbapenêmicos são a principal opção para o tratamento de infecções por bactérias Gram-negativas multiresistentes. Recentemente a resistência mediada por carbapenemases tem crescido, sendo observada no Brasil e ao redor do mundo. As carbapenemases mais descritas no Brasil são as serina cabapenemases KPC e OXA-48 em enterobactérias, OXA-23 em A. baumannii e as Metalo-beta-lactamases NDM, SPM. Objetivo: Padronizar uma metodologia para detecção de carbapenemases blakpc e blandm em bacilos Gram-negativos através de PCR em Tempo Real. Metodologia: Os ensaios de padronização foram realizados no ABI PRISM Prism7500 (Applied Biosystems) com cepas controle previamente identificadas por testes fenotípicos e PCR convencional como produtoras de KPC, NDM e não-produtoras. O controle endógeno utilizado foi o gene constitutivo 16SrRNA. A padronização seguiu cinco pontos principais: 1) Metodologia de extração, através de sonicação, lise térmica e lise de colônia diretamente durante a reação de PCR. 2) Definição da metodologia de ciclagem. 3) Otimização da reação com diferentes concentrações de sondas e iniciadores. 4) Comparação entre MasterMix NAT e IBMP. 4) Bioequivalência de sondas e iniciadores de diferentes fabricantes. 5) Análise da especificidade e sensibilidade do protótipo frente a 100 cepas previamente caracterizadas. 6) determinação do Limite de detecção do protótipo Resultados: As metodologias de extração testadas se mostraram igualmente eficazes com amplificação de blakpc e blandm, entretanto a lise térmica da colônia realizada durante a ativação enzimática da enzima Taq hot start possuía maior relação custo benefício, sendo mais rápida que as demais. O protocolo de ciclagem do CDC se mostrou tão eficaz quanto o estabelecido por Bio-Manguinhos, sendo o do CDC mais rápido. Os ensaios de otimização revelaram que as melhores concentrações de sondas e iniciadores testadas foram (0,2µM e 0,4µM respectivamente) com valores médios de Ct de 17,43 para KPC e 20,53 para NDM. Mesmo após a otimização realizada com o Master Mix IBMP e adição de ROX, este não apresentou resultados tão expressivos quando comparados com o MIX NAT. Quanto a Bioequivalência os melhores resultados foram encontrados com Sondas da marca BIOSEARCH e iniciadores da marca IDT. O protótipo padronizado possuiu 100% de especificidade para a detecção de KPC e NDM e 100% de sensibilidade. Mesmo após a diluição seriada por 10 vezes, o protótipo foi capaz de detectar a presença dos genes alvos em concentrações mínimas de DNA. A partir desta primeira etapa para a validação do protótipo foi possível determinar sua eficácia frente a um grande número de cepas, sendo necessária a análise de outros parâmetros para a validação total do protótipo.
Abstract
Hospital acquired infections (HAI’s) are considered as a serious public health problem. It has been present even in developed countries and underdeveloped countries. Health surveillance has an important role of controlling resistance dissemination between pathogens, in the hospital and in the community .The most important mechanism associated to beta-lactamic resistance is the beta-lactamases production. These enzymes are able to hydrolyze the chemical structure causing the loss of antimicrobial function. Carbapenems are the main option for treatment of multiresistant Gram-negative bacterial infections. Recently, the carbapenem resistance has increased in Brazil and worldwide. The most described carbapenemases in Brazil are KPC e OXA-48 in Enterobacteriaceae, OXA-23 in A. baumannii and the Metalo-beta-lactamases NDM and SPM. Methodology: The multiplex real-time PCR assays were performed in ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) according to CDC protocol for detection of KPC e NDM, using control strains previously characterized as KPC and/or NDM producers and non-producers by phenotypic tests, conventional PCR and DNA sequencing. The constitutive gene 16S rRNA was used as endogenous control. This study has followed six main steps: 1) Bacterial DNA extraction (sonication, thermal lyses, and enzymatic lyses direct from bacteria colony. 2) qPCR Cycle definition. 3) Optimization of distinct concentration of primers and probes. 5) Comparison between two different master Mix (NAT and IBMP). 4) Bioequivalence between probes and primers from two different brands. 6) Determination of limit of detection (LOD). Results: The DNA extraction strategies tested showed equal efficiency in amplifying both target genes. However, the termal lyses direct of a colony from Taq hot start action showed major relation cost-benefit, being faster than the others conditions tested. The protocol established by CDC was very efficient as well the established by Bio-Manguinhos, but the CDC protocol was faster. The trials for optimization of reactions revealed the best concentrations of probes and primers (0,2µM and 0,4µM respectively) with Ct mean of 17,43 for KPC and 20,53 for NDM. Even after optimization reactions and addition of ROX. The bioequivalence showed best results with probes produced by BIOSEARCH and primers produced by IDT. The prototype has 100% of specificity for detection of KPC and NDM, and 100% of sensibility. Even over serial 10-fold dilution, the prototype was capable to detect the target genes even with minimal concentration of DNA. Starting from this first step for validation, was possible to determine the effectiveness against 100 bacterial isolates, being necessary to analyze others parameters final validation of the prototype.
DeCS
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo RealCarbapenêmicos
Bactérias Gram-Negativas
Métodos de Análise
Controle de Qualidade
Vigilância Sanitária
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