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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33920
PAPEL DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO MAPK (JNK, P38 E ERK1/2) E P53 NA APOPTOSE INDUZIDA POR COMPLEXOS DE RUTÊNIO COM PIPLARTINA EM CÉLULAS DE CARCINOMA DE COLÓN HUMANO HCT116
Dias, Ingrid Rayssa Souza Baliza | Date Issued:
2019
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract in Portuguese
O câncer é uma doença multifatorial iniciada por mutações genéticas que causam um descontrole na proliferação celular, estas células cancerosas proliferam em desafio aos controles normais do organismo. Dentre os tratamentos para essa doença, a quimioterapia é um dos métodos mais eficazes; entretanto, os fármacos disponíveis atualmente apresentam limitações relacionados a alta toxicidade e ao desenvolvimento de resistência. A piplartina (piperlongumina) é uma molécula derivada de plantas que tem recebido intenso interesse devido às suas características anticancerígenas que visam o estresse oxidativo. A fim de potencializar os efeitos citotóxicos em células cancerígenas, tem sido utilizada a associação de compostos naturais com metais de transição, como o rutênio. Recentemente, nosso grupo de pesquisa sintetizou dois novos complexos de rutênio contendo a piplartina como ligante, os quais aumentaram a expressão de genes das vias MAPK e p53. OBJETIVO: Assim, o presente trabalho visou estudar o papel destas vias de sinalização na apoptose induzida por esses complexos, bem como avaliar sua eficácia in vivo. MATERIAL E MÉTODOS: Para verificar a participação das vias MAPK e p53 na morte celular induzida pelos complexos, foi utilizado o ensaio de anexina V/PI em células HCT116 pré-tratadas com os inibidores farmacológicos de JNK (SP 600125), p38 (PD 169316), ERK1/2 (U-0126) e p53 (pifitrina-α cíclica), e a fluorescência celular foi quantificada por citometria de fluxo. Fosfo-JNK2 (T183/Y185), fosfo-ERK1 (T202/Y204), fosfo-p38α (T180/Y182), fosfo-p53 (S15), MDM2 e fosfo-histona H2AX (S139) foram quantificados pela técnica de ELISA sanduíche. A citotoxicidade dos complexos foi também avaliada em modelo 3D de esferoides multicelulares de câncer formados a partir de células HCT116. A atividade antitumoral in vivo foi avaliada em camundongos CB17 SCID transplantados com células HCT116 e tratados com os complexos na dose de 15 μmol/kg, por via intraperitoneal, uma vez por dia durante 15 dias consecutivos. RESULTADO: O pré-tratamento com inibidores de JNK, MEK e p38 reduziu a apoptose induzida pelos complexos, indicando que a apoptose causada pelos complexos é mediada por essas vias, assim como a apoptose induzida pelos complexos foi prevenida pelo pré-tratamento com o inibidor de p53, indicando morte celular apoptótica mediada por uma via dependente de p53. O tratamento com os complexos induziu fosforilação de p53 e H2AX após 24 horas de incubação e de JNK2, ERK1 e p38α após 15 e 30 minutos de incubação. Descobrimos, também, que ambos os complexos são mais potentes do que a piplartina no modelo de cultura 3D com células HCT116. Os complexos CPR1 e CPR2 apresentaram taxas de inibição do crescimento tumoral in vivo de 35,06% e 29,71 %, respectivamente. CONCLUSÃO: Em conclusão, os complexos apresentaram maior citotoxicidade do que piplartina no modelo 3D e foram capazes de induzir apoptose mediada pela via MAPK por uma via dependente de p53 em células HCT116, bem como diminuir o seu crescimento tumoral em modelo de xenotransplante.
Abstract
Cancer is a multifactorial disease initiated by genetic mutations that cause a lack of control in the cell proliferation, these cancer cells proliferate in defiance of the body's normal controls. Among the treatments for this disease, chemotherapy is one of the most effective methods; however, currently available drugs have limitations related to high toxicity and the development of resistance. Piplartine (piperlongumine) is a plant-derived molecule that has received intense interest because of its anticancer properties that target oxidative stress. In order to potentiate cytotoxic effects in cancer cells, the association of natural compounds with transition metals, such as ruthenium, has been used. Recently, our research group synthesized two new ruthenium complexes containing piplartine, which increased gene expression of the MAPK and p53 pathways. OBJECTIVE: Thus, the present work aims to study the role of these signaling pathways in the apoptosis induced by these complexes, as well as to evaluate their effectiveness in vivo. MATERIAL AND METHODS: To verify the role of the MAPKs and p53 pathways in the complexes-induced cell death, we used the annexin V/PI assay in HCT116 cells pre-treated with the pharmacological inhibitors of JNK (SP 600125), p38 (PD 169316), ERK1/2 (U-0126) and p53 (cyclic pifithrin-α), and cell fluorecence was measured by flow cytometry. Phospho-JNK2 (T183/Y185), phospho-ERK1 (T202/Y204), phospho-p38α (T180/Y182), phospho-p53 (S15), MDM2 e phospho-histone H2AX (S139) were measured by sandwich ELISA in cell lysates. The cytotoxicity of the complexes were evaluated in the 3D model of multicellular cancer spheroids formed from HCT116 cells. In vivo antitumor activity was evaluated in CB17 SCID mice xenografted with HCT116 cells and treated with the complexes at dose of 15 μmol/kg, by intraperitoneal route, once a day for 15 consecutive days. . RESULTS: Pre-treatment with inhibitors of JNK, MEK and p38 reduced the apoptosis caused by the complexes, indicating that apoptosis is mediated by these pathways. Similarly, the apoptosis induced by the complexes was prevented by pretreatment with the p53 inhibitor, indicating that the apoptosis is mediated by a p53-dependent pathway. Treatment with the complexes induced phosphorylation of p53 and H2AX after 24 hours of incubation and JNK2, ERK1 and p38α after 15 and 30 minutes of incubation. We found that both complexes are more potent than piplartine in the 3D model of HCT116 cells. The complexes CPR1 and CPR2 showed in vivo tumor growth inhibition rates of 35.06% and 29.71%, respectively. CONCLUSION: In conclusion, the complexes presented higher cytotoxicity than piplartine in the 3D model and were able of inducing MAPK-mediated apoptosis by a p53-dependent pathway, as well as decreasing its tumor growth in xenograft model.
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