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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/27893
AUTENTICAÇÃO MOLECULAR DE 65 ISOLADOS CLÍNICOS E AMBIENTAIS DE COCCIDIOIDES SPP. E SEQÜENCIAMENTO DO GENE CSA
Bezerra, Cláudia de Carvalho Falci | Date Issued:
2011
Advisor
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Coccidioidomicose é micose sistêmica causada pelos fungos dimórficos Coccidioides immitis e C. posadasii , adquirida através de inalação de artroconídios infectantes. Em parasitismo, expressa forma característica em esférula, repleta de endósporos. Em saprofitismo e em cultivo as colônias possuem aspecto macroscópico algodoado, de cor branca a marrom-claro, e microscopicamente apresentam hifas hialinas, septadas e ramificadas com esp aços interseptais cheios de citoplasma alternados com áreas interseptais vazias, formando artroconídios intercalares, unidades infectantes facilmente aerossolizáveis. O semi-árido brasileiro foi recentemente incluído como área endêmica de coccidioidomicose. Por ser altamente infectante, é importante implantar uma técnica de identificação molecular de Coccidioides spp., para minimizar os riscos de manipulação do operador. Ta mbém é importante conhecer a dinâmica do fungo no Brasil através de um estudo de vari abilidade molecular. Este estudo objetivou identificar os isolados suspeitos por meio de marcador molecular específico (gene CSA) que reconhece o gênero, e analisar a variabilidade molecular de linhagens brasileiras de Coccidioides spp. através de sequenciamento A extração de ADN foi realizada de 65 linhagens (58 do Piauí, Brasil; seis dos Es tados Unidos da América (EUA) e uma da Argentina), mantidas em Coleção de Cultura conforme técnica previamente descrita (Burt et al, 1995). Para a identificação do gênero foi utilizado um par de primers específicos (Ci 1 \2013 5 \0301 AAG TTC TCA CTC CTC AGC GCT ATC G 3 \0301 e Ci 2 \2013 5 \0301 ACA TTA AGG TTC CTC CCC TTC AAC C 3 \0301) que se anela ao gene CSA . Para a tipagem molecular, foi realizada Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) com os primers específicos de 57 linhagens. Após es ta etapa, o produto amplificado foi purificado com kit de purificação e posteri ormente seqüenciado na Plataforma de Seqüenciamento de ADN PDTIS/FIOCRUZ. Como resultado, obtivemos 100% de positividade na identificação das linhagens estudadas e em nenhuma das linhagens controle foi detectada a banda, demonstr ando que o método foi 100% específico e sensível. No seqüenciamento do gene CSA , realizado de 57 linhagens, 56 foram caracterizadas como Coccidioides posadasii e uma linhagem, proveniente dos EUA, foi caracterizada como Coccidioides immitis
Abstract
Coccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungi Coccidioides immitis and C. posadasii, acquired through inhalation of infective spores. In parasitism shows a characteristic spherule full of endospores. In saprophytism and in suspected cultures it presents as a cotton-like colony ranging from white to light brown. Microscopically it shows septate hyaline branching hyphae, alternating degenerated empty interseptal spaces and cytoplasm forming arthroconidia. Recently, the Brazilian northeast semiarid region was included as an endemic area for coccidioidomycosis. As Coccidioides spp. are the most infective pathogenic fungi, it is important to develop a molecular tool for their identification, to protect the technicians. It is also important to better understand the fungal dynamic in Brazil, which can be achieved through a molecular variability study. The objective of this study was to identify the genus of suspected isolates, through a specific molecular method, that identifies the specific gene CSA, and also to analyze the molecular variability of Brazilian lineages of Coccidioides spp. by sequence analysis. DNA extraction was done from 65 lineages (58 from Piauí state, Brasil, six from the United States of America (USA) and one from Argentina) of Culture Collection as previously described (Burt et al, 1995) For genus identification we used a pair of specific primers (Ci 1 \2013 5´ AAG TTC TCA CTC CTC AGC GCT ATC G 3´ e Ci 2 \2013 5´ ACA TTA AGG TTC CTC CCC TTC AAC C 3´) that recognizes the specific gene. For molecular typing, we first performed PCR (Polimerase Chain Reaction) with the specific primer from 57 lineages. After this step, amplicon was purified with the purification kit and then sequenced on PDTIS/FIOCRUZ DNA Sequencing Platform. As results we obtained 100% of positivity for the molecular identification of all lineages studied. In contrast, all the control strains didn`t show the specific band, demonstrating that the method was 100% specific and sensitive. On the sequencing of CSA gene of 57 lineages, 56 were characterized as Coccidioides posadasii. The only lineage identified as Coccidioides immitis was from USA
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