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https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/25381
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E EXPRESSÃO FENOTÍPICA DA ENZIMA UREASE DE SPOROTHRIX BRASILIENSIS
Oliveira, Luã Cardoso de | Date Issued:
2016
Author
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Abstract in Portuguese
Desde 1998 se observa a maior e mais duradoura epidemia de esporotricose causada principalmente por Sporothrix brasiliensis transmitida por felinos no Rio de Janeiro, com mais de 4.000 casos humanos diagnosticados até o presente. Amplo espectro clínico é observado em pacientes provenientes desta epidemia, e sabe-se que estes podem estar associados com o estado imunológico do hospedeiro. Entretanto, não se pode descartar que a virulência dos isolados de S. brasiliensis possa gerar formas mais graves da doença. Em face da vasta gama de defesas imunológicas, fungos dimórficos são bem efetivos no estabelecimento de infecção, delineando assim a necessidade de um entendimento maior dos mecanismos da patogênese e dos seus fatores de virulência. Embora se tenha demonstrado que espécies clínicas do complexo Sporothrix produzem urease, até o presente o gene codificador da urease neste complexo ainda não foi identificado em todas as espécies, e consequentemente seu papel como fator de virulência é desconhecido. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar e isolar parcialmente o gene codificador da urease (URE) de S. brasiliensis e estabelecer o modelo tridimensional preditivo desta enzima. Para tanto, foram desenhados iniciadores a partir da análise por métodos computacionais usando como molde a sequência do gene URE de Sporothrix schenckii depositadas no European Nucleotide Archives (ENA), no site Primer3, e o isolamento parcial do gene SbURE foi realizado através de sequenciamento, a partir do DNA da cepa-tipo de S.brasiliensis (CBS 120339) que é produtora de urease de acordo com análise fenotípica A partir da sua sequencia de aminoácidos, depositada no banco de dados do NCBI foi utilizada para a descrição do sítio catalítico, alinhamento com sequencia de aminoácidos de S. schenckii e o desenho preditivo da proteína. Após a caracterização do gene outros três isolados provenientes de pacientes com diferentes formas clínicas da esporotricose, bem como um isolado urease negativo (S.brasiliensis IPEC-654-H), foram incluídos no estudo, para verificação da expressão de urease em meio de cultivo e testes moleculares. As provas fenotípicas demonstraram que todos os isolados do estudo, com exceção de um foram capazes de produzir urease em meio de cultura. Os iniciadores escolhidos foram capazes de hibridizar na sequencia e isolar uma região parcial do gene codificador para urease em todos os isolados, demonstrando 98% de identidade com a mesma região parcial em S. schenckii, assim como a sequencia de aminoácidos quando alinhadas. Através do desenho preditivo tridimensional da urease de S. brasiliensis, foi possível a identificação seu sítio catalítico, em comparação com outras ureases, de plantas e bactérias, estabelecendo assim sua identidade. Mais estudos, como por exemplo estudos in vivo, são necessários para um maior entendimento do papel dessa enzima na infecção por fungos do complexo Sporothrix spp
Abstract
Since 1998 it is observed the longest epidemic of sporothrichosis mostly caused by Sporothrix brasiliensis, transmitted by cats in Rio de Janeiro, where more than 4.000 human cases were diagnostic until now. A wide clinical spectrum is observed in patients with this mycosis, and it is known that this can be related with the immunological status of the patients. However, the virulence of certain S. brasiliensis strains can be also directly related with the generation of the most severe forms of this disease. Given the broad range of immunological defenses, dimorphic fungi are very effective in the establishment of infection, so it is necessary a better understanding of the mechanisms of the pathogenesis and virulence factor. It has been demonstrated that the clinical species of the Sporothrix spp. complex produce urease, however the urease coding gene has not been isolated yet. So, the main objective of this work was to characterize and isolate partially the urease (URE) coding gene of S. brasiliensis and the establishment of the tridimensional predictive model of this enzyme. For this reason, primers based on the Sporothrix scheckii sequence urease coding gene deposited at the European Nucleotide Archives (ENA) were designed using computational methods, on the website Primer3, and the partial isolation were realized through partial sequencing of the DNA of the typestrain of S. brasiliensis (CBS120339), which is urease positive by phenotypic methods The amino acid sequence of urease of S. brasiliensis strain 5110 deposited at the NCBI GenBank was used to describe the enzymatic catalytic site, amino acid sequence, alignment with S. schenckii urease and the predictive design of protein. After characterizing the gene other three isolates from patients with different clinical forms of sporotrichosis as well as an isolate negative for urease production in Christensen´s urea broth (S.brasiliensis IPEC-654-H), were included in the study in order to verify the urease expression in culture medium. The phenotypic tests had shown that all isolates, except one were able to produce urease in the culture medium. The selected primers were able of annealing to the sequence and to isolate the partial region of gene enconding urease in all isolates, demonstrating 98 % identity with the same gene partial region in S. schenckii, as well as in the aligned amino-acid sequences. Through the threedimensional predictive design of S. brasiliensis urease, it was possible to identify its catalytic enzymatic site after comparison to other ureases, from plants and bacteria, thus establishing its identity. Further studies, such as in vivo and in vitro studies, are needed for a better understanding of the role of this enzyme in the infection caused by the Sporothrix spp. complex
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