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DissertationCopyright
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2020-01-12
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NOVAS ABORDAGENS SOBRE O POTENCIAL ANTITUMORAL DE PRODUTOS NATURAIS E SEMI-SINTÉTICOS EM MELANOMA IN VITRO
Fontes, Sheila Suarez | Date Issued:
2017
Author
Advisor
Comittee Member
Affilliation
Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil.
Abstract in Portuguese
INTRODUÇÃO: O câncer constitui importante causa de morbidade e mortalidade em todo o
mundo e seus números continuam a aumentar demonstrando o impacto dessa doença para saúde
pública. Em relação ao melanoma, apesar de sua baixa incidência em relação as demais
neoplasias de pele, sua taxa de mortalidade é elevada, considerando seu risco aumentado para
o desenvolvimento de metástases. Tem-se observado significativo progresso no
desenvolvimento de novas terapias para o câncer. Entretanto, problemas relacionados à
toxicidade para células normais e o desenvolvimento de resistência permanecem como
limitação ao sucesso dos tratamentos. Assim as terapias em combinação apresentam papel
promissor devido às inúmeras vantagens como o aumento da eficácia por efeitos sinérgicos e a
superação da resistência aos medicamentos em comparação com a monoterapia. OBJETIVO:
Avaliar os efeitos da combinação de CQ:DETC e β-Lap:DETC sobre células de melanoma
murino, linhagem B16F10. METODOLOGIA: Células B16F10 e células Vero foram
utilizadas para ensaios de inibição, com diferentes concentrações dos fármacos isolados e
combinados. As avaliações de sinergismo e seletividade foram realizadas através de cálculo da
FIC e da razão entre a IC50 dos fármacos na linhagem Vero e B16F10. Para as análises em MET
e MEV as células foram tratadas por 24h com a IC50 dos fármacos isolados e combinados. Para
avaliação de morte celular e estresse oxidativo, utilizamos as sondas Anexina V, PI e DHE,
respectivamente. Para avaliação da toxicidade sistêmica, tratamos camundongos C57BL/6 com
os fármacos isolados e combinados e avaliamos marcadores hepáticos, renais e histopatologia.
RESULTADOS: A ação da combinação de CQ:DETC sobre células B16F10 na proporção 1:2
resultou em ação citotóxica, com IC50 de 13,40μM:26,81μM, respectivamente e para a
combinação β-Lap:DETC na proporção 1:20 apresentou IC50 0,32μM:6,4μM, respectivamente.
A ação combinada, avaliada em isobolograma, demonstrou perfil sinérgico para os efeitos de
75% de inibição para a combinação CQ:DETC e 50% e 75% de inibição para a combinação β-
Lap:DETC. Esta combinação, seguindo a mesma proporção, gerou CC50 para a combinação
CQ:DETC de 58,49μM:40,94μM, respectivamente, enquanto para a combinação β-Lap:DETC
foi 0,356μM:6,71μM, respectivamente em células VERO, resultando em seletividade in vitro.
As combinações promoveram acúmulo de espécies reativas de oxigênio sobre a forma de
radicais superóxido, observados por DHE e isso resultou em morte celular por via apoptótica,
preferencialmente. Esse achado foi corroborado por alterações morfológicas das células
observados por microscopia eletrônica de varredura, bem como por alterações ultraestruturais verificadas por microscopia eletrônica de transmissão. A segurança dos tratamentos isolados e
em combinação foi avaliada em camundongos C57BL/6, que resultou em discreta alteração nas
concentrações AST e ALT para os tratamentos isolados, o que não se observou nos tratamentos
em combinação. Não houve alteração nos níveis de ureia em nenhum dos tratamentos. Os
tratamentos também não promoveram lesões no tecido cerebral ou cardíaco, mas foram
observados danos hepáticos quando ministrados em monoterapia mas não nas combinações; e
renais em ambos tratamentos. CONCLUSÃO: As substâncias testadas demonstraram ação
citotóxica em melanoma murino in vitro, com baixa toxicidade sistêmica in vivo, o que sugere
que, quando utilizados em combinação são candidatos promissores à se tornar um novo método
terapêutico para o tratamento do melanoma. Contudo, mais experimentos são necessários para
elucidar outros mecanismos de ação.
Abstract
INTRODUCTION: Cancer is an important cause of morbidity and mortality worldwide and
its numbers continue to increase showing the impact of this disease on public health. Regarding
melanoma, despite its low incidence in relation to other skin neoplasms, its mortality rate is
high, considering its increased risk for the development of metastases. Significant progress has
been observed in the development of new therapies for cancer. However, problems related to
toxicity to normal cells and the development of resistance remain as a limitation to the success
of treatments. Thus combination therapies play a promising role because of the numerous
advantages such as increased efficacy by synergistic effects and overcoming drug resistance
compared to monotherapy. OBJECTIVE: To evaluate the effects of the combination of
CQ:DETC and β-Lap:DETC on murine melanoma cells, lineage B16F10. METHODOLOGY:
B16F10 cells and Vero cells were used for inhibition assays, with different concentrations of
the drugs isolated and combined. Synergism and selectivity evaluations were performed by
calculating the FIC and the ratio of the IC50 of the drugs in the Vero and B16F10 lineages. For
the MET and MEV analyzes the cells were treated for 24 hours with the IC50 of the drugs
isolated and combined. For evaluation of cell death and oxidative stress, we used the Annexin
V, PI and DHE probes, respectively. To assess systemic toxicity, we treated C57BL/6 mice
with the drugs alone and combined and evaluated hepatic, renal and histopathology markers.
RESULTS: The action of the combination of CQ:DETC on B16F10 cells in the ratio 1:2
resulted in cytotoxic action, with IC50 of 13.40μM:26.81μM, respectively and for the
combination β-Lap:DETC in 1:20 ratio presented IC50 0.32μM:6.4μM, respectively. The
combined action, evaluated in isobologram, showed synergistic profile for the effects of 75%
inhibition for the CQ:DETC combination and 50% and 75% inhibition for the β-Lap:DETC
combination. This combination, following the same ratio, generated CC50 for the CQ:DETC
combination of 58.49μM:40.94μM, respectively, while for the combination β-Lap:DETC was
0.356μM:6.71μM, respectively in VERO cells, resulting in vitro selectivity. The combinations
promoted accumulation of reactive oxygen species on the form of superoxide radicals, observed
by DHE and this resulted in apoptotic cell death, preferably. This finding was corroborated by
the morphological alterations of the cells observed by scanning electron microscopy, as well as
by ultrastructural alterations verified by transmission electron microscopy. The safety of the
isolated and combination treatments was evaluated in C57BL/6 mice, which resulted in a slight
change in AST and ALT concentrations for the isolated treatments, which was not observed in
the combination treatments. There was no change in urea levels in either treatment. Treatments
also did not promote damage to brain or cardiac tissue, but hepatic damage was observed when
given as monotherapy but not in combinations; and renal function in both treatments.
CONCLUSION: The substances tested demonstrated cytotoxic action in murine melanoma in
vitro with low systemic toxicity in vivo, suggesting that when used in combination they are
promising candidates to become a novel therapeutic method for the treatment of melanoma.
However, further experiments are needed to elucidate other mechanisms of action.
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