Advisor | Murta, Silvane Maria Fonseca | pt_BR |
Author | Moreira, Douglas de Souza | pt_BR |
Access date | 2017-06-27T19:24:26Z | |
Available date | 2017-06-27T19:24:26Z | |
Document date | 2017 | |
Citation | MOREIRA, Douglas de Souza. Análise fosfoproteômica e genômica funcional de linhagens de Leishmania spf. sensíveis e resistentes ao antimônio trivalente. 2017. 121 f. Tese (Doutorado em Ciências da saúde - Concentração Biologia Celular e Molecular)-Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2017. | pt_BR |
URI | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/19543 | |
Abstract in Portuguese | A leishmaniose é um complexo de doenças com ampla diversidade epidemiológica e clínica causada por protozoários parasitas pertencentes ao gênero Leishmania. A fosforilação de proteínas é uma das modificações pós-traducionais mais estudadas, que está envolvida em diferentes eventos celulares em Leishmania. Na primeira parte desse
estudo, nós realizamos uma análise fosfoproteômica comparativa de linhagens de L. braziliensis sensível e resistente ao antimônio trivalente (SbIII), utilizando eletroforese em gel diferencial bidimensional (2D-DIGE) seguida por espectrometria de massas. Para investigar a abundância diferencial de fosfoproteínas associada com resposta ao estresse induzido à droga e mecanismos de resistência ao SbIII, nós comparamos amostras não tratadas e tratadas com SbIII de cada linhagem. Análises comparativas revelaram um total de 116 spots que apresentaram diferença estatisticamente significativa na abundância de fosfoproteínas, incluindo 11 e 34 spots especificamente correlacionados com estresse devido ao tratamento com a droga e resistência ao SbIII, respectivamente. Foram identificadas 48 proteínas diferentes distribuídas em sete
categorias de processos biológicos. A categoria “enovelamento de proteínas/chaperonas e resposta ao estresse” está envolvida principalmente em resposta ao estresse com SbIII, enquanto que as categorias “antioxidante/detoxificação”, “processos metabólicos”, “processamento de RNA/DNA” e “biossíntese de proteínas” estão moduladas no caso de resistência à droga. Alinhamentos de sequências múltiplas foram realizados para validar a conservação de resíduos fosforilados em nove proteínas identificadas nesse estudo. Ensaios de Western blot foram conduzidos para validar a análise quantitativa do
fosfoproteoma. Os resultados mostraram níveis de expressão diferencial de três fosfoproteínas nas linhagens analisadas. Na segunda parte desse estudo, análises de Western blot demonstraram que as proteínas nucleosídeo difosfato quinase b (NDKb) e fator de elongação 2 (EF2) estão mais e menos expressas, respectivamente, na linhagem de L. braziliensis resistente ao SbIII, corroborando nossos dados anteriores do
fosfoproteoma. NDKb é responsável pela síntese de nucleosídeos rifosfatos e tem papel chave no metabolismo de purina em protozoários tripanossomatídeos. EF2 é um importante fator para síntese de proteínas. A superexpressão dos genes NDKb e EF2 nas espécies L. braziliensis e L. infantum foi realizada para investigar a contribuição destas proteínas no fenótipo de resistência ao SbIII. As linhagens de L. braziliensis superexpressoras de NDKb ou EF2 foram 1,6 a 2,1 vezes mais resistentes ao SbIII do que a linhagem sensível não transfectada. Em contraste, nenhuma diferença na susceptibilidade ao SbIII foi observada em L. infantum superexpressora de NDKb ou EF2. Ensaios de susceptibilidade mostraram que as linhagens de L. braziliensis superexpressoras de NDKb apresentaram elevada resistência à lamivudina, um agente antiviral, mas esta droga não alterou a atividade leishmanicida em associação com SbIII. O clone de L. braziliensis superexpressor de EF2 foi 1,2 vezes mais resistente ao inibidor da quinase de EF2 do que a linhagem sensível. Surpreendentemente, este
inibidor aumentou o efeito leishmanicida do SbIII, sugerindo que esta associação pode ser uma estratégia valiosa para a quimioterapia das leishmanioses. Portanto, esse novo estudo nos permitiu determinar o perfil do fosfoproteoma de L. braziliensis, identificando alguns candidatos potenciais para redes bioquímicas ou de sinalização associadas com
o fenótipo de resistência ao SbIII neste parasito. Além disso, nossos resultados representam o primeiro estudo de superexpressão dos genes NDKb e EF2 que demonstra um aumento de resistência ao SbIII em L. braziliensis, o que pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento das leishmanioses. | pt_BR |
Sponsorship | CNPq | pt_BR |
Language | por | pt_BR |
Rights | open access | pt_BR |
Subject in Portuguese | Leishmania spp. | pt_BR |
Subject in Portuguese | Resistência ao antimônio | pt_BR |
Subject in Portuguese | Análise fosfoproteômica | pt_BR |
Subject in Portuguese | Nucleosídeo difosfato quinase b | pt_BR |
Subject in Portuguese | Fator de elongação 2 | pt_BR |
Title | Análise fosfoproteômica e genômica funcional de linhagens de Leishmania spp. sensíveis e resistentes ao antimônio trivalente | pt_BR |
Type | Dissertation | pt_BR |
Defense date | 2017 | pt_BR |
Defense Institution | Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou | pt_BR |
Degree level | Mestrado Acadêmico | pt_BR |
Place of Defense | Belo Horizonte/MG | pt_BR |
Program | Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde | pt_BR |
Abstract | Leishmaniasis is a disease complex with wide epidemiological and clinical diversity caused by protozoan parasites belonging to the genus Leishmania. Protein phosphorylation is one of the most studied post-translational modifications that is involved in different cellular events in Leishmania. In the first part of this study, we performed a comparative phosphoproteomics analysis of antimony (SbIII)-resistant and -susceptible lines of L. braziliensis using a 2D-DIGE (two dimensional differential
gel electrophoresis) approach followed by mass spectrometry. In order to investigate the differential phosphoprotein abundance associated with the drug-induced stress response and SbIII-resistance mechanisms, we compared non-treated and SbIII - treated samples of each line. Pair wise comparisons revealed a total of 116 spots that showed a statistically significant difference in phosphoprotein abundance, including 11 and 34 spots specifically correlated with drug treatment and resistance, respectively. We identified 48 different proteins distributed into seven biological process categories. The category “protein folding/chaperones and stress response” is mainly implicated in response to SbIII treatment, while the categories “antioxidant/detoxification”, “metabolic process”, “RNA/DNA processing” and “protein biosynthesis” are modulated in the case of antimony resistance. Multiple sequence alignments were performed to validate the conservation of phosphorylated residues in nine proteins identified here. Western blot assays were carried out to validate the quantitative phosphoproteome analysis. The results revealed differential expression level of three phosphoproteins in the lines analyzed. In the second part of this study, Western blot analysis demonstrated that nucleoside diphosphate kinase b (NDKb) and elongation factor 2 (EF2) proteins are more and less expressed, respectively, in SbIII-resistant line of L. braziliensis, corroborating our previous phosphoproteomic data. NDKb is responsible for nucleoside triphosphates synthesis and it has key role in the purine metabolism in trypanosomatid protozoa. EF2 is an important factor for protein synthesis. Overexpression of NDKb and EF2 genes in L. braziliensis and L. infantum species was performed to investigate the contribution of these proteins in SbIII-resistance phenotype. NDKb or EF2-overexpressing L. braziliensis lines were 1.6 to 2.1-fold more resistant to SbIII than the untransfected wild-type line (WTS). In contrast, no difference in SbIII susceptibility was observed in L. infantum parasites
overexpressing NDKb or EF2. Susceptibility assays showed that NDKboverexpressing L. braziliensis lines presented elevated resistance to lamivudine, an antiviral agent, but it did not alter the leishmanicidal activity in association with SbIII. EF2-overexpressing L. braziliensis clone was 1.2-fold more resistant to EF2 kinase inhibitor than the WTS line. Surprisingly, this inhibitor increased the antileishmanial effect of SbIII, suggesting that this association might be a valuable strategy for leishmaniasis chemotherapy. Therefore, this novel study allowed us to profile the L.
braziliensis phosphoproteome, identifying several potential candidates for
biochemical or signaling networks associated with antimony resistance phenotype in this parasite. Furthermore, our findings represent the first study of NDKb and EF2 genes overexpression that demonstrates an increase of SbIII resistance in L. braziliensis which can contribute to develop new strategies for leishmaniasis treatment. | pt_BR |
Affilliation | Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. | pt_BR |
Subject | Leishmania spp. | pt_BR |
Subject | Antimony resistance | pt_BR |
Subject | Phosphoproteomic analysis | pt_BR |
Subject | Phosphoproteomic analysis | pt_BR |
Subject | Nucleoside diphosphate kinase b | pt_BR |
Subject | Elongation factor 2 | pt_BR |
Member of the board | Murta, Silvane Maria Fonseca | pt_BR |
Member of the board | Oliveira, Edward José de | pt_BR |
Member of the board | Pereira, Rosiane Aparecida da Silva | pt_BR |
Member of the board | Fernandes, Ana Paula Salles Moura | pt_BR |
Member of the board | Escobar, Patrícia Cuervo | pt_BR |
Member of the board | Babá, Elio Hideo | pt_BR |
DeCS | Leishmaniose | pt_BR |
DeCS | Leishmania | pt_BR |
DeCS | Proteoma | pt_BR |