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Title: Avaliação de biomarcadores de gravidade em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum classificados clinicamente e estratificados quanto à carga parasitária em estudos de corte transversal.
Authors: Solcà, Manuela da Silva
Advisor: Veras, Patrícia Sampaio Tavares
Coadvisor: Fraga, Déborah Bittencourt Mothé
Members of the board: Larangeira, Daniela Farias
Pinho, Flaviane Alves
Costa, Federico
Almeida, Maria da Conceição Chagas de
Veras, Patrícia Sampaio Tavares
Affilliation: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil
Abstract: INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV) é, principalmente, causada pelo protozoário Leishmania infantum nas Américas, podendo acometer o Homem e animais. Dentre estes, o cão é considerado o principal reservatório doméstico do parasito. O curso da LV canina (LVC) varia entre os animais, podendo alguns se mostrar resistentes à infecção, se mantendo subclínicos, e outros susceptíveis, que irão desenvolver sinais da doença. O estado de resistência ou susceptibilidade à LVC reflete na gravidade da infecção do animal, e não pode ser definido pelo quadro clínico apresentado ou por qualquer parâmetro isolado de resposta imune. OBJETIVO: Avaliar a carga parasitária como biomarcador parasitológico, as proteínas LJM11/LJM17 como biomarcadores de exposição à saliva do vetor, e identificar biomarcadores inflamatórios de gravidade da infecção por L. infantum em cães. Primeiramente, foi realizada a padronização de uma ferramenta diagnóstica de PCR quantitativa (qPCR), utilizando diferentes amostras biológicas (aspirado esplênico, linfonodos, pele, sangue, medula óssea e swab conjuntival) de cães sintomáticos provenientes da área endêmica de Jequié-BA. A avaliação da carga parasitária de L. infantum teve seu desempenho comparado com outras técnicas diagnósticas (cultura de aspirado esplênico, teste rápido e ELISA para LVC) empregando a análise de classe latente (ACL). Para essa análise, foi construída uma variável latente a ser empregada como padrão ouro para avaliação da acurácia desses métodos. Na avaliação inicia dos cães sintomáticos, a qPCR detectou DNA do parasita em 100% dos animais em pelo menos uma das amostras biológicas, sendo que todos foram positivos empregando-se o aspirado esplênico e 70% empregando-se o sangue. Utilizando a variável latente como padrão-ouro, a sensibilidade para a qPCR de aspirado esplênico (95,8%) foi maior do que as obtidas pela qPCR utilizando outras amostras biológicas e por outros testes diagnósticos. Desta forma, em uma segunda etapa, a acurácia da qPCR empregando-se aspirados esplênicos foi avaliada em uma amostra canina obtida de forma randômica (n = 800), coletada durante um estudo de corte transversal na área endêmica de Camaçari-BA. Utilizando a variável latente como padrão-ouro, novamente a sensibilidade para a qPCR de aspirado esplênico foi elevada (95%). Neste estudo de corte transversal foi possível também correlacionar a carga parasitária com a gravidade da infecção, existindo associação positiva significativa entre a intensidade da carga parasitária no baço e o número de sinais clínicos presentes nos cães. Nessa primeira parte do estudo, foi possível demonstrar que i) a utilização de aspirado esplênico na qPCR apresentou maior sensibilidade na detecção de DNA de L. infantum do que outras amostras biológicas; ii) a ACL pode ser usada para gerar um padrão ouro adequado para avaliação de técnicas diagnósticas, uma vez que esta técnica oferece uma avaliação mais completa dos resultados obtidos por diferentes métodos diagnósticos para LVC e iii) a carga parasitária se mostrou um bom biomarcador de gravidade clínica nos animais infectados por L. infantum. Posteriormente, após a reação de qPCR ter sido padronizada e validada empregando-se aspirados esplênicos, esta foi aprimorada para utilização em estudos epidemiológicos, sendo padronizada em formato duplex tanto na forma líquida como no formato em gel (ready-to-use), adicionando-se à reação primers específicos para a detecção simultânea de um gene constitutivo canino. Esse protocolo permitiu a detecção de até 0,1 parasitas por amostra. Adicionalmente, a detecção de DNA do hospedeiro na mesma reação simultaneamente fortaleceu o diagnóstico da LVC, agindo como controle interno da reação, reduzindo tempo de execução e diminuindo custos da reação. Após a padronização da qPCR duplex, foi realizado um estudo exploratório de uma amostra de cães coletada durante outro estudo de corte transversal, em Camaçari-BA, no qual se objetivou avaliar biomarcadores de exposição à saliva do vetor (proteínas LJM11/LJM17) e identificar biomarcadores inflamatórios, correlacionando-os à gravidade da LVC e à carga parasitária. A análise identificou uma bioassinatura distinta em cães com diferentes manifestações clínicas, caracterizada por uma diminuição dos níveis de LTB4 e de PGE2 e um aumento de CXCL1 e CCL2, de acordo com o agravamento da doença. Além disso, utilizando uma combinação de 3 parâmetros distintos (LTB4, PGE2 e CXCL1) como um marcador, este permitiu a discriminação entre escores clínicos diferentes utilizando uma curva ROC. Foi detectado também, que cães com escores clínicos elevados apresentaram-se, mais frequentemente, positividade para anticorpos anti-saliva e elevadas cargas parasitárias. Este estudo permitiu a avaliação e identificação de vários biomarcadores em cães, que podem ser importantes para auxiliar na avaliação do curso da doença e prognóstico por médicos veterinários, além de futuramente poder ajudar na distinção entre cães resistentes ou susceptíveis direcionando estratégias de controle da LVC em áreas endêmicas. CONCLUSÃO: Existem biomarcadores parasitológicos como a carga parasitária, biomarcadores imunológicos e inflamatórios como CXCL1, CCL2, LTB-4, PGE-2, além da produção de anticorpos específicos contra as proteínas LJM 11 e LJM 17 da saliva do vetor, que são capazes de diferenciar animais infectados por L. infantum de acordo com seus diferentes quadros clínicos.
Abstract: INTRODUCTION: In the Americas, visceral leishmaniasis (VL) is caused by the protozoan Leishmania infantum, which can affect humans and animals. Among these, dog is considered the main domestic reservoir of this parasite. Canine VL (CVL) clinical outcome varies among animals, some of which may be resistant to infection remaining subclinical, and others may be susceptible showing signs of the disease. The state of resistance or susceptibility to CVL reflects on the severity of infection in the animal and cannot be defined solely by the clinical condition presented or by any isolated parameter of the immune response. OBJECTIVE: Assess parasite load as parasitological biomarkers, LJM11/LJM17 proteins as sandfly saliva exposure biomarkers, and identify inflammatory biomarkers that indicates L. infantum infection severity in dogs. Firstly, we performed the standardization of a quantitative PCR diagnostic tool (qPCR) using different biological samples (splenic aspirate, lymph nodes, skin, blood, bone marrow and conjunctival swab) of symptomatic dogs from the endemic area of Jequié-BA. The evaluation of the parasitic load of L. infantum had its performance compared to other diagnostic techniques (splenic aspirate culture, rapid test and CVL ELISA) using latent class analysis (LCA). In this analysis, a latent variable was constructed to be used as a gold standard to evaluate the accuracy of these methods. In the initial evaluation of the symptomatic dogs, qPCR detected DNA from the parasite in 100% of the animals in at least one of the biological samples, all of which were positive using the splenic aspirate and 70% using the blood. Employing the latent variable as a gold standard, splenic aspirate qPCR sensitivity (95.8%) was greater than that obtained by qPCR using other biological samples and other diagnostic tests. Thus, in a second stage, the accuracy of qPCR using splenic aspirates was evaluated in a randomly obtained canine sample (n = 800), collected during a cross-sectional study in the endemic area of Camaçari-BA. Using the latent variable as a gold standard, qPCR sensitivity of splenic aspirate was again high (95%). In this cross-sectional study, it was also possible to correlate the parasite load with the severity of the infection, and there was a significant positive association between the intensity of the parasite load in the spleen and the number of clinical signs present in dogs. In this first part of the study, it was possible to demonstrate that i) the use of splenic aspirate in the qPCR presented greater sensitivity in the detection of L. infantum DNA than other biological samples; Ii) LCA can be used to generate a suitable gold standard diagnostic techniques assessment, since this technique offers a more complete evaluation of the results obtained by different diagnostic methods for LVC and iii) the parasite load proved to be a good biomarker of clinical severity in animals infected with L. infantum. Next, after the qPCR reaction was standardized and validated using splenic aspirates, the same was improved for use in epidemiological studies, being standardized in both liquid and ready-to-use gel format, adding specific primers for the simultaneous detection of a canine constitutive gene. This protocol allowed the detection of up to 0.1 parasites per sample. In addition, the detection of host DNA in the same reaction simultaneously strengthened the LVC diagnosis, acting as internal reaction control, reducing execution time and reducing reaction costs. After the standardization of the duplex qPCR, we performed an exploratory study of a sample of dogs collected during another cross-sectional study carried out in Camaçari-BA. We aimed to evaluate the biomarkers of vector saliva exposure (LJM11/ LJM17 proteins) and to identify inflammatory biomarkers, correlating them with CVL severity and parasite load. Assessment of protein expression of profile biomarkers identified a distinct biosignature that could cluster separately animal groups with different clinical scores. Increasing severity scores were associated with a gradual decrease of LTB-4 and PGE-2, and a gradual increase in CXCL1 and CCL2. Discriminant ROC analyses revealed that combined assessment of LTB-4, PGE-2 and CXCL1 was able to distinguish dogs with different clinical scores. Dogs with the highest clinical score values also exhibited high parasite loads and positivity for anti-saliva antibodies. This study allowed the evaluation and identification of several biomarkers in dogs, which may be important to assist in the evaluation of the disease course and prognosis by veterinarians, and in the future to be able to help distinguish between resistant or susceptible dogs directing CVL control strategies in endemic areas. CONCLUSION: There are parasitological biomarkers such as parasite load, immunological and inflammatory biomarkers such as CXCL1, CCL2, LTB-4, PGE-2, and the production of specific antibodies against LJM 11 and LJM 17 sandfly salivary proteins, which are able to differentiate animals infected by L. infantum according to their different clinical condition
Keywords: Canine Visceral Leishmaniasis
Biomarkers
qPCR
Dog
keywords: Leishmaniose Visceral Canina
Biomarcadores
qPCR
Cão
Issue Date: 2017
Citation: SOLCÀ, M. da S. Avaliação de biomarcadores de gravidade em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum classificados clinicamente e estratificados quanto à carga parasitária em estudos de corte transversal. 2017. 151 f. il. Tese (Doutorado em Patologia Humana) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Gonçalo Moniz, Salvador, 2017.
Date of defense: 2017-02-02
Place of defense: Salvador/Ba
Department: Coordenação de Ensino
Defense institution: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Gonçalo Moniz
Program: Pós-Graduação em Patologia
Copyright: open access
Appears in Collections:CPqGM - Teses de Doutorado dos Profissionais

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