Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular (PGBCM)
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/6873
2024-03-29T07:56:25ZIdentificação da família P450 como potenciais alvos moleculares para o reposicionemento de fármacos para as leishmanioses
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/61066
Identificação da família P450 como potenciais alvos moleculares para o reposicionemento de fármacos para as leishmanioses
Silva, Raphaela Lopes da
Espécies pertencentes ao gênero Leishmania são agentes etiológicos das leishmanioses, um grupo de doenças que possuem grande impacto e distribuição mundial e são consideradas doenças reemergentes e negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde. O arsenal terapêutico disponível para o tratamento dessas doenças é limitado, contando com apenas um fármaco com atividade por via oral, a miltefosina, que não é licenciada no Brasil para o tratamento em humanos. Os fármacos tradicionais, como os antimoniais pentavalentes, anfotericina B e petamidina provocam diversos efeitos colaterais, possuem alta toxicidade, alto custo, além de crescentes casos de resistência. A inovação radical no desenvolvimento de fármacos é um processo que consome muito tempo e requer grande investimento financeiro e de recursos humanos. O reposicionamento de fármacos é uma abordagem que pode ser útil, pois essa estratégia oferece a vantagem de trabalhar com compostos comprovadamente seguros, possuem um perfil farmacológico favorável em humanos e tem determinadas atividades biológicas já descritas. Enzimas do complexo citocromo P450 (P450) são a uma superfamília de proteínas encontradas em todos os seres vivos, com papel importante no metabolismo de xenobióticos, além de participarem em diversas vias metabólicas, como a biossíntese de esteróis e ácidos graxos, entre outras. Diversos trabalhos já vêm sugerindo a inibição da CYP51 (esterol C14-desmetilase) de Leishmania spp. como um possível alvo para a quimioterapia das leishmanioses. Desta forma, neste trabalho analisamos o genoma de L. infantum em busca de enzimas P450 que ainda não tenham sido descritas e que sejam similares às enzimas P450 humanas. Foi realizada a busca no genoma do parasito por sequências similares a enzimas P450 humanas e foram selecionados 4 hits estatisticamente significativos. Análises de busca in silico de motivos característicos da superfamília P450 revelaram que os hits selecionados possuem assinaturas específicas de enzimas P450, assim como atividades biológicas ligadas a função de oxidação-redução. A identificação e localização desses motivos e predição de estruturas secundárias dos hits revelaram a co-localização dos motivos dentro das 4 sequências e também a conservação das estruturas secundárias α-hélice e β-folha. Dados in silico de expressão de mRNA e expressão proteica desses hits, assim como ensaios experimentais de expressão de mRNA demonstraram que estas sequências podem ser potencialmente expressas em proteínas. Esses resultados mostraram que as sequências P450 putativas de L. infantum possuem potencial para serem classificadas na superfamília de enzimas P450 e para serem candidatos a alvos para o reposicionamento para o tratamento das leishmanioses
2020-01-01T00:00:00ZRosuvastatina como estratégia terapêutica no dano cognitivo decorrente da malária cerebral experimental
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/60728
Rosuvastatina como estratégia terapêutica no dano cognitivo decorrente da malária cerebral experimental
Fernandes, Tamires da Cunha
A malária é uma doença infecciosa parasitária de abrangência mundial. A Malária Cerebral (MC) é a complicação mais grave e letal da infecção desencadeada pelo Plasmodium falciparum. Esse quadro grave, consequente da adesão de hemácias parasitadas e não parasitadas, além de leucócitos, nos capilares cerebrais, leva a inflamação, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (NOS), além da disfunção da barreira hematoencefálica (BHE), ativação de astrócitos e de microglia, levando ao desenvolvimento de danos celulares irreversíveis, culminando com o dano cognitivo. As estatinas estão se tornando cada vez mais alvos de pesquisas farmacológicas. Apesar de comumente usados para o controle de dislipidemias e doenças cardiovasculares, evidências crescentes têm demonstrado que, devido a ação anti-inflamatória, antioxidante e anti-excitotóxica neuronal esses fármacos poderiam ser capazes de modular a neuroinflamação. O presente estudo esteve focado na avaliação, em particular da rosuvastatina, que já demonstrou efeito anti-inflamatório em quadros de doenças infecciosas sistêmicas e proteção em modelos experimentais de doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson. Avaliamos o efeito da rosuvastatina na reversão do dano cognitivo consequente da MC, focando na neuroinflamação e na sinalização celular associada aos processos mnemônicos. Para isso, camundongos machos C57BL/6 (L. 025/2015) foram previamente inoculados com P. berghei ANKA (PbA). A partir dos primeiros sintomas de MC, foi realizado o tratamento com rosuvastatina (10-20 mg/kg v.o.). Para a análise cognitiva, os animais foram tratados em conjunto com o antimalárico cloroquina (25 mg/kg v.o.) do sexto ao décimo segundo dia pós infecção. O tratamento com rosuvastatina não reduziu a carga parasitária, o desenvolvimento de malária grave e a mortalidade dos animais, porém reverteu o desenvolvimento de dano cognitivo nos animais infectados tratados com 10 mg/kg em conjunto com a cloroquina. Ainda foram avaliados aspectos condizentes com a neuroinflamação e neurodegeneração. O tratamento com rosuvastatina foi capaz de reverter significativamente níveis séricos e teciduais de IFN-γ e de TNF-α frente à infecção, além de diminuir os níveis de MPO, subprodutos da nitrosilação de proteínas e peroxidação lipídica (3-nitrotirosina e 4-hidroxinonenal, respectivamente). O tratamento com rosuvastatina preveniu a disfunção da BHE, verificado pelo extravasamento do corante Azul de Evans, bem como os perfis de microgliose, através da expressão de Iba 1, e astrogliose, através da marcação de GFAP e S100β. Verificamos que a infecção com PbA promoveu um desbalanço das funções sinápticas a partir de uma alta expressão de PSD-95 e sinaptofisina, proteínas pós e pré-sinápticas, que foi revertido por rosuvastatina, bem como a alta fosforilação de Erk 1/2. Assim, nota-se que rosuvastatina desempenhou papel neuroprotetor e anti-inflamatório frente à MC, prevenindo as sequelas cognitivas a partir da prevenção do surgimento do dano tecidual, oferecendo sustentação para estratégias terapêuticas frente à disfunção neurocognitiva
2020-01-01T00:00:00ZCaracterização funcional dos polimorfismos detectados no vírus da febre amarela durante o surto no Brasil em 2017
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/57868
Caracterização funcional dos polimorfismos detectados no vírus da febre amarela durante o surto no Brasil em 2017
Furtado, Nathalia Dias
A febre amarela é uma arbovirose com altas taxas de mortalidade, que ocasiona surtos esporádicos na África e na América do Sul. O vírus da febre amarela (Yellow fever virus – YFV) responsável pela disseminação da doença no Brasil desde a virada do século, pertence a uma sub-linhagem moderna do genótipo sul-americano I, a sub linhagem 1E. A partir de 2015, foi detectado um conjunto de nove marcadores genéticos no YFV, que ocasionou em 2017 e 2018 um surto sem precedentes, desde o início da vacinação. Esses marcadores representam uma assinatura molecular inédita, considerando todas as sequências do vírus disponíveis em domínio público. Das nove substituições, oito estão localizadas nas proteínas NS3 e NS5. A localização por modelagem tridimensional de NS3 e NS5 sugeriu que tais alterações poderiam influenciar nas funcionalidades destas proteínas, e talvez, desempenhar algum papel de adaptação aos hospedeiros. Este trabalho propõe estudar o efeito das alterações genéticas nas proteínas NS3 e NS5 em diferentes aspectos biológicos do ciclo replicativo viral: na infecção viral em culturas celulares e em camundongos; na modulação da resposta antiviral por interferon do tipo I (IFN-I); e na atividade enzimática do domínio MTase da proteína NS5. Em uma primeira análise, avaliou-se o papel na infecção viral de quatro vírus isolados de primatas não humanos, dois carreando a assinatura molecular. Estes vírus foram comparados quanto à capacidade de infectar células de mosquitos e de mamíferos, e quanto à neurovirulência em camundongos. Observamos que os fenótipos apresentados pelos vírus isolados eram resultado de múltiplos fatores genéticos adicionais, e não estavam relacionados à assinatura molecular, permitindo a identificação de potenciais marcadores de virulência. Em uma segunda abordagem, foram sintetizados cinco YFV a partir do isolado selvagem ES-504 de 2017, com diferentes composições genéticas em relação aos marcadores nas proteínas NS3 e NS5. A administração viral intracerebral em camundongos evidenciou que animais inoculados com os vírus sintéticos não apresentaram diferenças em relação aos indicadores de neurovirulência, enquanto os animais inoculados com os isolados virais divergiram neste parâmetro. Os YFV sintéticos ainda foram avaliados quanto à infectividade em camundongos susceptíveis AG129, e os resultados mostraram que os marcadores na proteína NS3 não ocasionaram diferenças em infectividade, enquanto os marcadores da assinatura molecular na proteína NS5 resultaram em atenuação viral. Portanto, os resultados obtidos indicam que os marcadores presentes na proteína NS5 podem ser os principais envolvidos na modulação de virulência viral. A caracterização da atividade enzimática da proteína NS5 MTase foi avaliada comparando a proteína NS5 do surto 2017-2019 com uma variante enzimática de YFV circulante nos anos 2000s. A cinética enzimática e os ensaios de inibição sugerem que a proteína do YFV 2017-2019 tem afinidade menor pelo doador de metila que a proteína presente nos vírus do recente surto, indicando que estas alterações podem interferir na conformação do sítio de ligação a este substrato. Porém, o impacto estrutural das substituições não influenciou na replicação viral em modelo celular, nem na neurovirulência em camundongos. Por fim, os resultados em modelo celular de resistência à tratamento com IFN- I mostraram que os marcadores no domínio MTase influenciam no aumento da sensibilidade a resposta imune mediada por esta citocina. Os resultados obtidos neste projeto sugerem que a assinatura molecular do YFV 2016-2019 nas proteínas NS3 e NS5 representam marcadores do YFV que modulam replicação e virulência em modelo celular e murino. Estes resultados contribuíram para o melhor entendimento das bases biológicas da infecção viral e patogênese do YFV circulante no Brasil desde 2015.
2022-01-01T00:00:00ZAvaliação da resposta imune humoral produzida contra a proteína do circunsporozoíto (CSP) de Plasmodium falciparum associados à esporos de Bacillus subtilis
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/56011
Avaliação da resposta imune humoral produzida contra a proteína do circunsporozoíto (CSP) de Plasmodium falciparum associados à esporos de Bacillus subtilis
Almeida, Maria Edilene Martins de
Atualmente, ainda não existe vacina para malária com capacidade de gerar uma proteção com alta eficácia, sendo as formulações que contêm a proteína de superfície de circunsporozoíto (PfCSP) as mais avançadas nos estudos em humanos. Uma etapa importante no desenvolvimento de uma vacina, além da identificação do antígeno, é avaliar como este será apresentado, bem como o efeito imunoestimulatório dos componentes da formulação (imunoestimulantes). Os esporos de Bacillus subtilis têm sido avaliados há duas décadas como partículas vacinais adjuvantes, as quais promovem a elevação da resposta humoral após a coadministração com antígenos tanto acoplados ou integrados à sua superfície. Logo, somando as características imunoestimulantes, probióticas e de alta resistência dos esporos com a grande capacidade de estimular uma resposta humoral protetora da PfCSP, este trabalho buscou investigar em modelo murino a possível utilização deste método como uma nova formulação de adjuvante para uma vacina contra malária. Para tanto, duas abordagens de apresentação foram testadas: acoplando a PfCSP recombinante (rPfCSP, produzida em Escherichia coli) na superfície dos esporos e recombinando o B. subtilis de modo a expressar o antígeno na superfície de seus esporos. Com as ferramentas produzidas, camundongos Balb/c foram imunizados via intranasal, sendo a resposta imune humoral (IgG total e subclasses) acompanhada por ELISA indireto. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que a proteína rPfCSP foi produzida com êxito no sistema de expressão usando E. coli como hospedeiro, no qual estava presente porção solúvel do lisado bacteriano. As imunizações por via intranasal utilizando a rPfCSP acoplada aos esporos revelaram que estes podem estimular uma maior produção de anticorpos, mais rápida e por um período mais longo contra o antígeno rPfCSP quando comparada ao grupo estimulado apenas com a proteína recombinante. Além disso, foi observada uma resposta imune de perfil balanceado Th1/Th2 após análise do perfil de produção das subclasses. A recombinação da proteína PfCSP em B. subtilis foi obtida com sucesso, esta foi expressa na superfície dos esporos pelo endereçamento obtido com fusão à proteína C de revestimento do esporo( CotC), no qual não foram observadas clivagens do antígeno-alvo nos imunoensaios realizados, indicandoque esta não sofreu ação das proteases ainda presentes no hospedeiro utilizado. Os esporos de B. subtilis recombinados com PfCSP foram capazes de induzir uma resposta imune por via intranasal com níveis de IgG elevados que se mantiveram circulantes por 150 dias, apresentando um perfil de resposta imune predominante Th1. Este foi o primeiro estudo que buscou avaliar o potencial uso de esporos de B. subtilis como adjuvante de um antígeno candidato vacinal para malária. Os resultados promissores aqui obtidos podem reacender o interesse no potencial uso da via de mucosa, como forma não invasiva para obtenção de proteção contra a esta doença
2022-01-01T00:00:00Z